【⼲货分享】细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项
1949 年⾄ 1960 年这⼀段时间可以称为冷冻保存的“⽢油时期"，这⼀时期对⽣物材料的冷冻保存⼀般都是以⽢油作为保护剂。Lovelock（1959）等⼈发现了⼀种新的化学保护剂，这就是⼈们熟悉的⼆甲基亚砜（DMSO）。⽽且，⽤于冷冻保存的仪器也有明显的发展。⽬前，⽆论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻⽤品和设备以及各种⽣物材料的保存与复苏技术都已⼗分成熟和完备。
冷冻与复苏原理
在低于-700C 的超低温条件下，有机体细胞内部的⽣化反应极其缓慢，甚⾄终⽌。⽔在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯⽔中，随着温度的降低，细胞内外的⽔分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏⽽引起细胞死亡。
这种因细胞内部结冰⽽导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的⽔分会⾸先结冰，从⽽使得未结冰的溶液中电解质浓度升⾼。
如果将细胞暴露在这样⾼溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分⼦会受到损坏，细胞便发⽣渗漏，在复温时，⼤量⽔分会因此进⼊细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升⾼⽽导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。
当温度进⼀步下降，细胞内外都结冰，产⽣冰晶损伤。但是如果在溶液中加⼊冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的⽔分⼦结合，从⽽降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。
在复苏时，⼀般以很快的速度升温，1-2 分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较⼤的冰晶，也不会暴露在⾼浓度的电解质溶液中过长的时间，从⽽⽆冰晶损伤和溶质损伤产⽣，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。⽽且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不⼀样。
冷冻速率
冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发⽣如下变化：当细胞被冷⾄-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂⽽降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷⾄-5~-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰⽽细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的⽔分⼦会⽐细胞外部分结冰溶液中的⽔分⼦具有更⾼的化学能。其结果是，细胞内⽔分⼦为了和细胞外⽔分⼦保持化学能的平衡，会向细胞外流动。
冷冻保存温度
冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞⽣化反应极其缓慢甚⾄停⽌，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和⽣物体以及使⽤不同的冷冻保存⽅法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度(-1960C)是⽬前最佳的冷冻保存温度。在-1960C时，细胞的⽣命活动⼏乎完全停⽌，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，⼀般⽣物样品在-1960C下均可保存⼗年以上。应⽤-700C~-800C保存细胞，短期内对细胞的活性⽆明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰
点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。
复苏速率
冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升⾼的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。⼀般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C⽔浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较⼤冰晶⽽造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤⾮常快，往往在极短的时间内发⽣。
冷冻保存⽅法
按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存⽅法可分为⾮玻璃化和玻璃化冻.存两种。⾮玻璃化冻存是利⽤各种温级的冰箱分阶段降温⾄-700C~-800C，然后直接投⼊液氮进⾏保存；或者是利⽤电⼦计算机程控降温仪以及利⽤液氮的⽓、液，按⼀定的降温速率从室温降⾄-1000C以下，再直接投⼊液氮保存的⽅法。以该种⽅法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利⽤多种⾼浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投⼊液氮进⾏冻存的⽅法。以该中⽅法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但⽬前细胞冻存zui常⽤的仍是前⼀种⽅法。
⾮玻璃化冻存⽅法
下⾯以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例：在使⽤DMSO前，不要对其进⾏⾼压灭菌，因其本⾝就有灭菌作⽤。⾼压灭菌反⽽会破坏其分⼦结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对⼈体有毒，故在配制时最好带⼿套。在将细胞冻存管投⼊液氮时，动作要⼩⼼、轻巧、以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对⽪肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻⼿套、⾯罩、⼯作⾐或防冻鞋。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有⾼活⼒，还要确保⽆微⽣物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存⼀段时间后，要复苏1~2管，以观察其活⼒以及是否受到微⽣物的污
染。冻存管宜采⽤塑料冻存管，不宜使⽤玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，⽴即投⼊37^ 400C温⽔中，温差很⼤，玻璃安瓿瓶容易爆炸⽽发⽣危险。
玻璃化冻存⽅法
以下以⼈单核细胞为例：玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使⽤。⽬前，该⽅法已在胚胎冷冻⽅⾯得到⼴泛应⽤，但很少应⽤于⼀般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的
冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较⾼，室温下对细胞具有毒性(但在40C时毒性⼤为减弱)。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进⾏。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产⽣很⾼的渗透压，造成细胞膜的损
伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有⾜够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。
冻存细胞的复苏⽅法及注意事项
⾮玻璃化冻存复苏⽅法
主要材料:
(1)仪器设备：恒温⽔浴箱、⾼速离⼼机。
(2)培养⽤液：完全培养液。
(2)培养⽤液：完全培养液。
复苏过程:
(1)调配370C~ 400C的温⽔，或将恒温⽔浴箱的温度调节⾄370C~ 400C。
(2)从液氮中取出冻存管，⽴即投⼊370C~400C温⽔中迅速晃动，直⾄冻存液完
全溶解。
(3)将细胞冻存悬液转移到离⼼管内，加⼊约5ml培养液，轻轻吹打混匀。
(4)将细胞悬液经800~1000r/min离⼼5min，弃上清夜。
(5)向细胞沉淀内加⼊完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶
内，补⾜培养液进⾏培养。
结果:
复苏后的细胞应该保持其冻存时的活⼒，活细胞数达90%以上。
注意事项:
细胞冻存悬液⼀旦融解后，要尽快离⼼除去冷冻保护液，防⽌冷冻保护剂对细胞产⽣毒性。实验⼈员在复苏细胞过程中，同样应具有⾃我保护意识，避免被液氮冻伤。
玻璃化冻存复苏⽅法
主要材料:
(1)设备:⾼速离⼼机。
(2)培养⽤液：添加20%胎⽜⾎清的Hanks平衡盐溶液、培养液。
操作过程:
(1)将冻存管从液氮中取出，⽴即投⼊冰浴中5min。复温速率约5600C/min。
⼀次可以进⾏多个冻存管的复苏。
(2)将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离⼼管中。
(3)沿离⼼管壁缓慢加⼊已在冰浴中预冷的含20%胎⽜⾎清的Hanks平衡盐溶
液。qian10min以0.2m1/min的速度加⼊，后10min以0.5ml/min的速度加⼊，接
着的15min以0.75m1/min的速度加⼊，最后30min以1ml/min的速度加⼊。全过
程约为65min，都在冰浴中进⾏。
(4)将稀释后的细胞悬液以400r/min离⼼5min，去除上清。向细胞沉淀中加⼊
培养液重新悬浮细胞，⽤于培养。
结果:
复苏后的细胞应该保存其冻存时的活⼒，活细胞数达90%以上。
注意事项:
复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程⼀样，不能在室温下⽽必须在40C冰浴中进⾏，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产⽣毒性。稀释过程也要缓慢进⾏，保证有⾜够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免⾼渗透压的损伤。
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